前言

BiTE是一种双特异性 T 细胞接合剂，已被开发为免疫治疗分子。传统的 T-cell engager（BiTE）构建由两个单链可变抗体片段（scFv）组成，分别靶向肿瘤相关抗原（TAA）和T细胞标记物。第一个scFv-BiTE，靶向CD3和CD19的Blinatumomab^®于2014年12月被FDA批准用于治疗白血病，但在使用BiTE治疗实体肿瘤治疗方面，容易引起严重脱靶等不良事件，效果不佳。为了克服传统 BiTE 的局限性，开发新的 BiTE 势在必行，基于纳米抗体的 BiTE （Nb-BiTE）就是这样的候选者之一。本期小编给大家介绍一种增强T细胞免疫治疗的新平台—Nb-BiTE。该分子通过将 T 细胞和肿瘤靶标结合，诱导T细胞产生对肿瘤细胞的细胞毒性，来增强免疫治疗。

研究亮点

该项研究报道了一种由两个Nb构建的BiTE，分别靶向T细胞表面的CD3分子和实体肿瘤表面的CD105分子，目前关于两个结构均为Nb的BiTE少见报道。文中假设CD105-CD3/Nb-BiTE通过CD3 Nb末端与T细胞CD3抗原之间的特异性结合以及CD105 Nb特异识别和结合TAA，来触发TCR/CD3复合物的构型变化，从而启动膜信号转导并激活肿瘤特异性 T 细胞。这种激活会导致T细胞增殖和细胞因子的分泌，从而增强抗肿瘤免疫反应。

CD105-CD3/Nb-BiTE构建及验证

采用hCD3和hCD105蛋白免疫健康的骆驼，收集PBMC后采用噬菌体展示平台筛选Nb，将CD3 Nb和CD105 Nb的基因序列通过Gly4Ser连接在一起，形成CD105-CD3/Nb-BiTE，它可将T细胞重定向至肿瘤细胞和心血管内皮细胞（图1a）。以同种方式构建TTE-CD3/Nb-BiTE，作为同型对照。通过PCR将Nb-BiTE克隆到质粒中，电转，表达，纯化，成功表达出Nb-BiTE，SDS-PAGE显示大小为35KD左右（图1b）。

图1 CD105-CD3/Nb-BiTE 的构造和机理示意图

CD105-CD3/Nb-BiTE作用机制的研究

为了验证CD105-CD3/Nb-BiTE与靶点的特异性结合，研究者将不同类型的细胞与CD105-CD3/Nb-BiTE混合孵育，并用PE偶联的抗his单抗（Sigma-Aldrich，USA）对细胞表面的CD105-CD3/Nb-BiTE进行染色。在每个实验组中，用PBS进行空白对照，TTE-CD3/Nb-BiTE作为阴性对照，使用流式细胞术分析结合率。

实验结果显示，表达CD105的细胞（如Bel7404 HepG2 TDVEC细胞）与CD105-CD3/Nb-BiTE有很高的结合率，而CD105阴性的细胞（如SCC9 293T细胞）则不与CD105-CD3/Nb-BiTE结合。值得注意的是，TTE-CD3/Nb-BiTE几乎不与各种类型的细胞结合。这些结果表明，CD105-CD3/Nb-BiTE与靶点具有高度特异性结合(图2)。

图2 CD105-CD3/Nb-BiTE 与不同类型细胞结合流式图

进一步检测CD105-CD3/Nb-BiTE是否具有激活T细胞并增强其对肿瘤细胞的杀伤作用。从体内治疗试验后的肿瘤中分离出T细胞，并通过流式细胞术分析这些细胞的表型变化。结果显示，CD105-CD3/Nb-BiTE能够促进T细胞表达CD25和CD69分子，这两个分子通常与T细胞的活化和增殖相关（图3d和e）。此外，在一定效靶比（E:T=10:1）下，CD105-CD3/Nb-BiTE能够以剂量依赖的方式增强T细胞对特定靶肿瘤细胞（Bel7404）的裂解作用，但对不表达CD105的293T细胞无影响（图3f）。这表明CD105-CD3/Nb-BiTE的激活作用是特异性的，主要针对表达CD105的肿瘤细胞。CD105-CD3/Nb-BiTE还能促进T细胞分泌几种抗肿瘤细胞因子，包括IL-2、IFN-γ和TNF-α，并且这些细胞因子的含量可以通过酶联免疫试剂盒在肿瘤细胞悬液中进行测定（图3g）。同时发现CD105-CD3/Nb-BiTE对健康的 BALB/c 小鼠无组织毒性（图3h）。这些结果进一步支持了CD105-CD3/Nb-BiTE在免疫治疗中的潜在应用价值。

图3 CD105-CD3/Nb-BiTE激活T细胞并增强其对肿瘤细胞的杀伤作用

CD105-CD3/Nb-BiTE体内药效的评估

为了检测CD105-CD3/Nb-BiTE的体内药效作用，通过皮下植入HepG2细胞，在NOD/SCID小鼠中建立癌细胞系来源的异种移植物（CDX）模型，五日后给药。每天一次，连续五天经尾静脉向小鼠注射CD105-CD3/Nb-BiTE（10 μg）和人T细胞（4×107）的混合物，以评价其抗肿瘤疗效（图i）。统计小鼠存活数量后，制作接受治疗至伦理终点（90天）的小鼠的Kaplan-Meier生存曲线（图j）。第一次给药后，测量肿瘤大小，计算体积，后每三天测量一次。使用GraphPad Prism软件进行统计分析，制作给药后30天内接受治疗的小鼠的肿瘤体积分布图（图k）。

结果显示，接受CD105-CD3/Nb-BiTE治疗组小鼠比其它所有对照组存活时间都要长，60%的小鼠到试验终点仍然存活。图k表明，与其它对照组相比，CD105-CD3/Nb-BiTE是抑制肿瘤生长的最佳药物。

图4 CD105-CD3/Nb-BiTE体内药效评估

小结

CD105-CD3/Nb-BiTE在体外和体内均显示出优异的安全性和治疗效果。这种双特异性纳米抗体BiTE，可能会成为促进T细胞免疫治疗的通用平台。这归因于纳米抗体自身的优势，如体积小、结构简单、稳定性、多功能性、易于设计和生产，最重要的是，具有高特异性和安全性。

参考文献：

Yang XM, Lin XD, Shi W, Xie SX, Huang XN, Yin SH, Jiang XB, Hammock BD, Xu ZP, Lu XL. Nanobody-based bispecific T-cell engager (Nb-BiTE): a new platform for enhanced T-cell immunotherapy. Signal Transduct Target Ther. 2023 Sep 4;8(1):328. doi: 10.1038/s41392-023-01523-3. PMID: 37661200; PMCID: PMC10475457.

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