前言

噬菌体展示技术以其独特的优势在生物技术领域取得了显著进展。本指南详细解答从构建文库到筛选抗体的技术实施中常见问题。通过优化辅助噬菌体选择、提高展示和转化效率、设计高质量引物，以及采用适当的抗原呈递和筛选策略，研究人员可以显著提升文库质量和筛选成功率。同时，避免筛选到非特异性抗体的方法和措施，进一步保证了筛选结果的可靠性和实用性。

Q1. 噬菌体单价展示的本质与目的？

A. 在噬菌体展示技术中，通常使用含有pⅢ噬菌粒展示载体的辅助噬菌体感染大肠杆菌以制备噬菌体颗粒。这些颗粒中的融合蛋白表达呈泊松分布，约90%的颗粒仅展示野生型pⅢ蛋白，少于10%的颗粒展示一个融合蛋白拷贝，展示多个拷贝的情况极少。因此，大多数展示融合蛋白以单价形式存在。

单价展示与多价展示相比，单价展示在筛选过程中，可以去掉弱结合的抗体。而多价展示由于存在avidity 效应，会把弱结合的克隆也富集出来。

Q2. 常见辅助噬菌体差异与选择

A. 含全长gⅢ的辅助噬菌体：

M13KO7、R408、VCSM13为含全长gⅢ的辅助噬菌体，也是最标准最常用的一类辅助噬菌体。M13KO7是M13噬菌体的一个突变体，带有一个质粒复制起点，卡那霉素抗性基因以及G6125T的突变基因Ⅱ。VCSM13是M13KO7的一个突变体。R408是f1噬菌体的一个突变体，带有一个IRI的突变并且不带抗生素抗性标记基因，删除了其IG中的24bp的区段从而使其包装带有完整信号的单链DNA优于其自身单链DNA。使用这些含有全长gⅢ的辅助噬菌体超感染后产生的辅助噬菌体和重组噬菌粒颗粒的滴度高，目的蛋白的特异性强，但是由于这些辅助噬菌体基因组不具有包装信号，展示水平也较低，可能会导致筛选特异性阳性克隆失败。 

gⅢ删除的辅助噬菌体：

M13MDD3.2、R408d3、VCSM13d3是通过分别删除辅助噬菌体M13KO7、R408、VCSM13的gⅢ（1579-2851）而构建的，再使用携带gⅢ的辅助质粒提供pⅢ蛋白。这就使得噬菌体组装时，pⅢ的唯一来源仅是由噬菌粒编码的融合蛋白，由于丝状噬菌体的pⅢ蛋白有3-5个拷贝，这在一定程度上提高的噬菌体的展示水平，但所展示蛋白的平均亲和力降低了，而且这种辅助质粒在一定程度上会造成污染，这就严重限制了删除gⅢ的辅助噬菌体的使用。

gⅢ缺陷的辅助噬菌体：

hyperphage是最近由Rondot S等人从M13KO7基因组中删除gⅢ的开放阅读框（ORF)，仅保留启动子和信号肽，并在信号肽后加一个短肽，同时构建大肠杆菌细胞包装系（DH5α/pⅢ）来提供pⅢ蛋白的，这就避免完全删除gⅢ带来的极性效应和污染的情况，提高了噬菌体产量，也使hyperphage的滴度大大提高。CT辅助噬菌体是删除了VCSM13基因组上gⅢ的具感染力的N1和N2区而保留CT区，用辅助质粒pUC19-gⅢ提供pⅢ蛋白。由于缺乏负责感染的N1和N2区，因此CT辅助噬菌体援救的重组噬菌体必须嵌入融合蛋白，才具有感染性。

辅助噬菌体Ex-phage、Phaberge、Ex12和VCSM13N1都在gⅢ中引入了琥珀终止密码子，从而提供包装效率。

Q3. 构建高质量噬菌体文库的要点

A. 构建高质量展示文库需要从以下5个方面进行考虑：

①PBMC 总数（理论库容）

PBMC是文库的关键，其总数决定了我们需要构建文库的大小规模，同时也决定了文库的多样性。

②RNA 的质量

 使用试剂盒提取RNA，确保高纯度。

③抗体多样性（germline 分布）

抗体多样性是指引物能不能很好的覆盖物种的germline分布，需要注意的地方是引物的设计与引物合成的质量。

关于引物的设计a.可以根据germline的序列进行设计 b.需要考虑germline的表达丰度 c.尽量不要采用简并引物，容易出现偏向性

关于引物的质量：我们发现国内的一些大厂为了追求方便与利润，你要求PAGE或者HPLC纯化，他们基本都是脱盐，大家拿到引物后一定要先进行测试。

④转化子总数（library size）

转化子总数决定了库容的大小，一般要求库容量是理论多样性的10到100倍。需要注意的是转化子的总数不等于文库的多样性。

⑤背景克隆比例

背景克隆是指没有插入片段的克隆与读码框错误的克隆，这类克隆生长速度远远超过插入正确片段的克隆，导致文库质量降低。因此需要提高文库的插入率与提高引物的质量。

Q4. 如何提高文库展示效率

A. 前面介绍到采用M13KO7的展示效率一般比较低，大约只有10%的噬菌体颗粒展示了抗体，90%都没有展示。提高展示效率的方法包括添加诱导剂如IPGT诱导表达；或更换展示效率更高的辅助噬菌体如hyperphage 与Ex-phage等。

Q5. 如何提高大肠杆菌转化效率

A. 选择高效率的电转感受态细胞，能有效的提高大肠杆菌转化效率从而增加噬菌体文库的库容，在噬菌体展示文库构建过程中，使用比较多的感受态细胞有TG1、XL1-Blue、SS320等。在进行转化实验时，要想获得高的转化效率，质粒和连接产物的纯度、电转的条件、质粒和连接产物的加入量以及操作的规范性也是尤为重要的。

Q6. 建库引物设计原则

A. 引物长度为20-30个碱基，既能保证与目标序列的结合，又能降低引物间的相互干扰。引物Tm值应略高于目标序列的解链温度，以便在PCR过程中顺利结合。引物的GC含量应接近目标序列的GC含量，以提高引物与目标序列的结合效率。避免引物的自我互补，以免影响PCR扩增效果。尽量不要选择简并引物。

Q7. 噬菌体文库的保存方法

A. 不当的保存方法会降低噬菌体的效价，原则上噬菌体文库在50%的甘油中低温保存（-70℃以下）可以保存较长时间。

Q8. 抗原的呈递方法及适用条件

A. 抗原的呈递方法有直接包被的抗原呈递、间接包被的抗原呈递、通过完整细胞筛选的抗原呈递等方法。直接包被的抗原呈递适用于分子量较大，构象稳定的抗原，间接包被可用于直接包被效果较差，抗原分子量较小，表位难以充分暴露的靶分子，就可以借助生物素-链霉亲和素系统或者其他的标签分子进行抗原的固定，提高抗原呈递的效果。由于重组表达的抗原与细胞膜上的抗原构象不一致，导致使用重组蛋白进行筛选无法获得结合细胞膜表面抗原的抗体时，我们可以采用HEK或CHO细胞构建瞬转或稳转过表达细胞系，或高表达肿瘤细胞系，来呈递抗原，使用细胞直接进行筛选。

详细内容请参阅公众号文章--------噬菌体展示抗体筛选之抗原呈递

Q9. 筛选方法

A.常见的筛选方法有正筛选，负筛选，竞争筛选，交叉筛选等。

正筛选是最基础的筛选方式，直接筛选到结合靶蛋白的噬菌体抗体。

负筛选是针对性去除非特异性抗体的手段，在噬菌体抗体筛选过程中，靶抗原的标签与材料、与靶抗原结构相似的抗原干扰等原因容易使我们筛选到非特异抗体，此时我们可以进行负向筛选，提高筛选效率。

竞争筛选是将抗体与靶抗原和非靶抗原同时结合，可筛选到针对靶抗原亲和力更高的抗体，同时扣除结合非靶抗原的部分抗体。

交叉筛选目的在于降低抗体富集的偏向性，主要针对不同物种之间的抗原，可以采用使用不同物种的同个抗原进行交叉富集筛选，提高获得交叉抗体的可能性。

详细内容请参阅公众号文章--------噬菌体展示抗体筛选之筛选策略

Q10. 如何避免筛选到非特异性抗体

A. 在噬菌体筛选过程中，很多原因会导致筛选到非特异性抗体，针对不同的情况我们有不同的解决措施，例如，筛选到与抗原标签结合的非特异性抗体，我们可以选择更换不同标签的抗原进行筛选，或者进行负筛选来降低非特异性抗体的比例。如果筛选到结合封闭液的抗体，我们可以选择更换合适的封闭液，或者交叉使用不同的封闭液来避免这种情况。如果是筛选到识别背景细胞系（CHO或者HEK293)的抗体,可以更换不同的背景细胞系进行筛选或者进行负筛选。

Q11. 如何筛选得到多样性好、高亲和力的抗体

A. 靶分子的浓度，结合时间，洗涤强度不同可能都会导致筛选结果的差异，抗原和抗体结合是一个动态的过程，高亲和力的抗体在较大的选择压力下也依然能够与抗原有力的结合，因此我们可以采用增大选择压，如降低靶分子浓度，减少结合时间，增大洗涤强度来筛选更高亲和力的抗体。相反，若想要获得多样性更好的抗体，我们需要减小选择压，尤其是在进行第一轮筛选时能够从构建的文库中尽量多地捕获阳性克隆，才能保持文库的多样性，保证一轮的洗脱产物在10^4~10^7 之间，不能高于这个数量级也不能低于这个数量级。

Q12. 阳性克隆的检测方法

A. 筛选获得的噬菌体抗体经过辅助噬菌体的包装之后会在pⅢ蛋白上融合表达，我们就可以采用酶联免疫吸附试验 (ELISA)或者流式细胞荧光分析技术（FACS)进行检测。

①Phage ELISA

phage ELISA是最常用的检测方法，将抗原包被到酶标板上，封闭之后加入噬菌体上清液，再加入辣根过氧化物酶标记的抗M13二抗，最后进行显色。一般情况下在OD450波长显色值到达1.0以上我们认为是阳性克隆。

②Phage FACS

利用流式细胞荧光分析术检测噬菌体抗体与细胞的结合情况，噬菌体上清结合细胞之后再加入荧光标记的抗M13二抗，根据荧光信号判断检测克隆是否为阳性克隆。

③细胞裂解液

由于M13噬菌体是丝状的，非常长，容易粘连，导致非特异。对于天然文库与合成文库，尽量不要采用phage-ELSIA的方法进行克隆验证，而是尽可能的利用TG1宿主菌20%的泄露表达，再采用噬菌粒上的标签进行检测。

了解更多纳米抗体相关内容，可关注<阿帕克生物>微信公众号，获取最新资讯~