前言

过去30年间，纳米抗体（Nbs)的研究迅猛发展。虽然大多数Nbs是经骆驼科动物免疫后筛选获得，但近年来构建的合成纳米抗体库在亲和力和稳定性方面展现出了生成高质量纳米抗体的潜力，这种合成方法相比使用动物具有独特的优势。本期内容介绍合成纳米抗体文库在设计过程中的考量因素。

合成文库的优势与局限

优势：

1. 无需动物免疫。

2. 适用于免疫原性弱或有毒的靶标。

3. 可多项目共用一个合成文库。

4. 获得抗体周期更短。

5. 框架区具有优化的物理化学性质。

局限：

1. 需要大型文库。

2. 亲和力可能低于免疫文库。

3. 框架区和可变区的组合存在稳定性或可溶性较低的可能性。

框架选择

Saerens及其同事们在合成纳米抗体库的发展中做出了开创性贡献，设计并验证了第一个“通用”框架cAbBCII10，源自针对β-内酰胺酶II的Nb。该框架因其高稳定性、在细菌中的良好表达能力以及在缺乏典型二硫键的情况下仍能保持功能，至今广泛应用于新合成库的设计中。

近年来，研究人员开发了新的策略来获取高度稳定的框架。这些框架不仅能够支持各种CDR长度，在还原性环境（如细胞质）中也能发挥功能，同时还实现了人源化，而不会失去溶解度、稳定性或亲和力。

Nb框架选择时需要考虑的因素：

· 框架设计策略：可基于不同Nb集合的共识序列，但结果需经全面实验验证。

· 溶解性和稳定性：良好的溶解性避免高分子聚集物形成，稳定的熔解温度对各种化学反应至关重要。

· 二硫键引入：非典型二硫键可显著增强稳定性，但可能影响表达水平，需针对性解决。

· 细胞表达水平：选择高表达的框架对于实验室和大规模生产都至关重要。

· 免疫原性：Nb框架人类化可降低免疫原性，尤其适用于治疗应用和人体内成像。

图1 合成文库的设计策略和期望的物理化学特性

框架区的优化设计

框架区是纳米抗体的骨干，决定其稳定性和溶解性。优化策略包括：

1. 选择高稳定性序列：挑选具有出色热力学稳定性的天然纳米抗体序列。

2. 引入亲和性增强突变：在框架区序列中引入有利于提高亲和力的突变。

3. 优化codon使用：根据宿主细胞的偏好调整序列，提高蛋白表达水平。

这些设计确保了框架区的优异性能，为后续CDRs优化奠定基础。

CDR区设计

CDR区的设计基于每个环的长度引入的不同设计。通常情况下，CDR1和CDR2的长度保持在5到8个氨基酸之间，而CDR3的长度则在6到18个氨基酸之间变化。设计中常见的策略是将CDR1和CDR2固定为特定长度，而CDR3可以设计为几种不同长度。

在大多数情况下，CDR1和CDR2的设计遵循部分或完全随机化的原则，以重现天然抗体库中的氨基酸多样性。相比之下，CDR3的常见做法是对每个位置进行完全随机化，允许所有20种天然氨基酸的出现，但通常会排除半胱氨酸，以避免二聚体形成、聚集或折叠问题的出现。

氨基酸的随机化通常通过使用简并密码子来实现。例如，NNS或NNK简并性编码可以涵盖20种天然氨基酸的总共32种密码子。尽管这种方法经济实惠，但其缺点是可能出现终止密码子，导致截断的无功能分子的产生。此外，高度的密码子冗余可能导致某些氨基酸的偏向。为了精确控制随机化，减少不需要的氨基酸出现的可能性，有时会采用精确但成本较高的三核苷酸DNA组装方法。这种方法的主要优势在于可以精确地编码所需的氨基酸，从而在每个位置上实现精确控制的随机化。

表达系统

合成纳米抗体库构建中一个关键问题是选择合适的表达系统。目前，噬菌体展示是最常用的系统，其他系统包括核糖体展示和细胞展示（如酵母、哺乳动物细胞或细菌展示）。这些系统在实验复杂性和允许库规模方面各有特点。

核糖体展示库能够提供极大的多样性，达到10^12数量级，但操作复杂，需要经验丰富的实验操作技术。噬菌体展示系统的库规模约为10^9数量级，相比核糖体展示小三个数量级，但其操作简便灵活，因此在科研中广受欢迎。酵母展示库的容量约为10^8，其优势在于可以通过流式细胞术对克隆进行筛选。每种表达系统都有其独特的优势和限制，研究人员需要根据具体需求和实验条件选择最合适的系统。

理论多样性与实际多样性

丰富多样性是合成库设计的关键，理论上恰当的框架选择和精细的CDR设计可以筛选出稳定且高亲和力的纳米抗体。然而，实际构建的库的多样性远远低于理论值。若20个CDR位点进行完全随机化，理论组合数是20^20，约为10^26。而实验上能获得的最大独特序列数约为10^12，两者之间差了14个数量级。尽管通过定制随机化策略可以缩小这一差距，但理论库与实际库的多样性差异仍然很大。这意味着，即使用相同的CDR设计多次构建库，每次得到的子库都会有所不同。此外，即便使用天然存在的氨基酸进行随机化，也无法完全模仿天然库的特性，因为天然库的多样性不仅取决于每个位置的氨基酸类型，还包括这些氨基酸组合形成的整体结合位点的复杂性。

小结

免疫库一直是纳米抗体的主要来源，然而，随着合成库不断证明其作为稳定、高亲和力纳米抗体替代来源的价值，且成本更低，速度更快，这种情况可能会有所改变。下期内容将介绍已报道的多种合成纳米抗体库，并讨论它们在构建和验证中所采用的不同方法。

参考文献：

Valdés-Tresanco, M.S.; Molina-Zapata, A.; Pose, A.G.; Moreno, E. Structural Insights into the Design of Synthetic Nanobody Libraries. Molecules 2022, 27, 2198. https://doi.org/10.3390/ molecules27072198

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