前言

近年来，合成纳米抗体库在筛选出高质量纳米抗体方面取得了显著进展，这在大量引用文献中得到了充分体现。本文介绍四个引用高频的合成纳米抗体库的设计策略，并探讨其在构建和验证过程中所采用的不同方法。

NaLi-H1 噬菌体展示文库 ^[1]

Moutel等人（2016年）报道了第一个完全合成的人源化羊驼单域抗体噬菌体展示库（NaLi-H1）。该库选用优化的人源化单域抗体（hs2dAb）为支架，具备高度多样化，能够无需动物免疫即获得高亲和力的结合物。NaLi-H1针对多种靶标进行了筛选，包括荧光蛋白、肌动蛋白、微管蛋白、p53、HP1以及活性RHO GTP酶的构象抗体，突显了该库在治疗应用中的潜力。

框架序列选择和验证：

1. 筛选高度稳定的天然纳米抗体，并将其碳末端与HA标记的氯霉素乙酰转移酶(CAT)融合。

2. 通过大量抗生素环境下菌株的生长情况来评估融合纳米抗体的功能性。

3. 选择一个最优框架序列(sdAbD10)，并设计人源化版本(hs2dAb)。将这两种框架分别与Anit-lam1 VHH的CDR嫁接，验证其稳定性和功能性。

CDR设计：

1. CDR1和CDR2长度固定为7个氨基酸，氨基酸序列的选取模拟自然的多样性。

2. 降低疏水性氨基酸出现概率，减少聚集倾向。

3. CDR3完全随机化，长度覆盖9、12、15和18个氨基酸。

文库构建：

采用三核苷酸DNA组装法合成纳米抗体基因，插入改造后的质粒中，转化到TG1大肠杆菌菌株。构建出含有约30亿个重组克隆的文库，无效克隆率约为4%。

文库验证：

随机选取24个克隆，检测其溶解性和热稳定性，在被加热到90°C后，其中70%的克隆能够恢复其溶解性。针对多种特性不同的抗原(如mCherry、EGFP、Tubulin、β-actin、p53、HP1α、RhoGTPase等)筛选出高亲和力的特异性纳米抗体，并证明其在细胞质内的结合功能。通过亚细胞定位抗体筛选，获得了能特异性识别HER2细胞表面区域的纳米抗体。所得纳米抗体的亲和力范围从50pM到10nM，与免疫法或亲和力成熟获得的水平相当。

酵母表面展示合成纳米抗体库 ^[2]

McMahon等人（2018）报道了一种新的合成纳米抗体库，该库采用基于结构的方法进行设计。该工作的重点是开发了酵母表面展示的体外纳米抗体筛选平台。

框架设计：

框架结构来自羊驼基因IGHV1S1-IGHV1S1S5的共识框架。

CDR设计：

1. CDR设计旨在重现现有纳米抗体晶体结构中观察到的氨基酸自然多样性。

2. CDR1中4个位点和CDR2中1个位点进行了全面随机化。

3. 对于CDR3，采用了3种不同长度(7、11、15个氨基酸)进行全面随机化。

文库构建：

采用两步叠加和延伸PCR(OE-PCR)方法构建基因文库。最终构建的酵母展示文库的库容约估为1×10⁸。对480,000个独特序列的分析证实了随机化位置的频率和变异性符合预期。使用了一个649个氨基酸的连接肽，包括N端工程化的配偶因子α前体蛋白和C端的GPI锚定序列。大多数用于分析的纳米抗体显示出高产量(>20 mg/L)。

文库验证：

功能验证通过选择针对四类不同抗原的纳米抗体来进行：2种溶性蛋白(人血清白蛋白和人脂联素)和2种膜蛋白(β2AR和A2AR)。获得了一种对人血清白蛋白高度特异的纳米抗体，但亲和力较低(430nM)。获得了几种特异针对β2AR和A2AR活性、拮抗剂结合构象的纳米抗体，亲和力在44-151nM之间。

Concave, loop, and convex文库^[3]

Zimmermann等人（2018年）基于对纳米抗体晶体结构的结构分析，特别是对CDR3长度的研究，发现短的CDR3（6个氨基酸）形成凹形表面，中等长度的CDR3（12个氨基酸）表现出“环”的突起，而较长的CDR3（16个氨基酸）则呈现凸形表面。基于这一研究，他们选择了几种先前报道的纳米抗体作为模板，为每种结合表面形状构建一个合成文库。

框架设计：

基于这些观察，研究者从先前报道的纳米抗体中选出适应每种结合形状的纳米抗体作为框架模板。为了验证这些框架的稳定性，在随机化的位置上生成了丝氨酸和苏氨酸突变体，保持疏水核心和施加构象限制的氨基酸（如脯氨酸）不变。结果显示，突变体纳米抗体的熔点（Tm）相比其前体显著提高了21–35°C。

CDR设计：

1. 针对CDR区域采用了不同的三核苷酸混合物，以平衡带电、极性、芳香族和非极性氨基酸，调整整体的疏水性。这样可以降低选择膜蛋白时粘性结合体的富集，并减少聚集的可能性。

2. 三种库的理论多样性分别为凸面库8.3×10^17、环状库4.3×10^19和凹面库2.8×10^22。

文库构建：

通过组装PCR生成含有CDR的DNA片段，然后采用Type IIS限制酶进行两步连接构建三个文库。使用核糖体显示技术表达这些文库，该方法允许更大的文库规模(9×10¹²)。

文库验证：

针对4种不同抗原(MBP、ABC转运蛋白TM287/288、ENT1和GlyT1)进行了验证。从各个文库中筛选到了针对转运蛋白亲和力达0.5 nM的纳米抗体。对TM287/288的选择过程进行了优化，得到了亲和力达2nM的纳米抗体。针对GlyT1和ENT1等难靶标，也成功筛选到了高亲和力的纳米抗体。这些结果表明合理设计的CDR和包含多种CDR3长度，是获得针对各种抗原的高亲和力合成纳米抗体的有效策略。

CeVICA文库 ^[4]

Chen等人（2020年）基于1030个Nbs序列和298个晶体结构分析,开发了CeVICA（无细胞VHH鉴定与聚类分析）平台。该平台结合了合成纳米抗体库、核糖体展示以及通过CDR定向聚类分析进行的计算预测。与先前的研究不同，这项工作不仅设计了合成纳米抗体库，还将体外亲和力成熟整合进入计算。

框架设计：

1. 设计了由不同版本的框架段组成的组合框架，包括3个版本的frame1、1个版本的frame2、3个版本的frame3和1个版本的frame4。

2. 这些框架的版本分别源自：从分析的天然Nb集合中提取的共识序列；天然Nb A310；一种与GFP结合的纳米抗体。

CDR设计：

1. CDR长度的选择与以前的研究略有不同，分别为CDR1包含7个氨基酸、CDR2包含5个氨基酸、CDR3包含6、9、10或13个氨基酸，这些长度与天然Nb中观察到的最常见CDR长度相匹配。

2. 在所有随机化位点使用了所有氨基酸，包括半胱氨酸。

文库构建：

使用核糖体展示技术获得了3.7 × 10¹¹个完整序列的多样性文库。

文库验证：

通过三轮筛选，分别获得了针对EGFP和SARS-CoV-2 spike蛋白受体结合域(RBD)的纳米抗体。

基于CDR相似性对获得的纳米抗体进行聚类分析，排除了针对两种抗原的共同结合体。在16个获得的纳米抗体中，3个为强结合，8个为弱结合，3个为非结合。6个纳米抗体(3个强结合、3个弱结合)在使用SARS-CoV-2 Spike假病毒的中和实验中显示>30%的抑制作用。经过体外成熟化过程，最强的中和抑制剂的IC50达到62.7nM，与在人类患者中发现的抗体相当。

小结

在过去的二十年中，合成纳米抗体库在一个由免疫库主导的领域中逐渐占据了一席之地，目前已有一个合成库（NaLi-H1）被商业化应用。这些库的成功案例展示了合成方法在生成具备高亲和力和稳定性的纳米抗体方面的巨大潜力。随着研究的不断深入和技术的持续优化，预计合成纳米抗体库在未来的医学诊断和治疗中将扮演越来越重要的角色。

参考文献：

[1]. Moutel S, Bery N, Bernard V, Keller L, Lemesre E, de Marco A, Ligat L, Rain JC, Favre G, Olichon A, Perez F. NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies. Elife. 2016 Jul 19;5:e16228. doi: 10.7554/eLife.16228.

[2]. McMahon C, Baier AS, Pascolutti R, Wegrecki M, Zheng S, Ong JX, Erlandson SC, Hilger D, Rasmussen SGF, Ring AM, Manglik A, Kruse AC. Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies. Nat Struct Mol Biol. 2018 Mar;25(3):289-296. doi: 10.1038/s41594-018-0028-6.

[3]. Zimmermann I, Egloff P, Hutter CA, Arnold FM, Stohler P, Bocquet N, Hug MN, Huber S, Siegrist M, Hetemann L, Gera J, Gmür S, Spies P, Gygax D, Geertsma ER, Dawson RJ, Seeger MA. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. Elife. 2018 May 24;7:e34317. doi: 10.7554/eLife.34317.

[4]. Chen, X., Gentili, M., Hacohen, N. et al. A cell-free nanobody engineering platform rapidly generates SARS-CoV-2 neutralizing nanobodies. Nat Commun 12, 5506 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-25777-z

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