前言  

目前较为常见的用药方式有五种：口服、注射、吸入（治疗哮喘的药）、局部用药（各种膏药）和滴鼻。其中以口服和注射最为常见。那么药物从进入人体到消耗殆尽需要多长时间呢？这时就要引入半衰期这个概念了。半衰期就是从注射完毕开始算起，到血浆内药物剩一半所需要的时间。请注意，谈到半衰期，都是指“血浆内”的药物浓度。常规抗体通常半衰期较长，因为分子量较大，而且能够特异性地和FcRn结合（图1），而FcRn能够保护抗体不被溶酶体降解，抗体随FcRn转运至细胞膜表面后失去与FcRn的结合，重新释放进入血浆，从而延长了抗体的半衰期^[1]。与常规抗体相比，纳米抗体最大的短板是血浆内的半衰期非常短，虽然这使得其在体内成像方面大展身手，但限制了其在治疗领域的应用。因此，如何提高纳米抗体的半衰期是纳米抗体在体内应用的一大瓶颈。

图1. FcRn对IgG代谢的调控机制

纳米抗体的半衰期

自从1993年首次报道以来，大量的研究表明纳米抗体具有很好的应用前景，尤其是在很多疾病的诊断和治疗方面，纳米抗体都有着不俗的表现。然而对于蛋白药物来说，肾小球的滤过界限一般在60kDa左右。也就是说小分子量的抗体片段或衍生物，例如纳米抗体（15kDa）和scFv（28kDa）甚至Fab（50kDa）都会通过肾小球的滤过作用从体内清除，导致其拥有较短的半衰期。其中，纳米抗体在所有抗体类型中分子量最小，半衰期往往只有几十分钟。

图2. 不同形式的抗体的结构及分子量

常用的纳米抗体半衰期延长方案

目前关于纳米抗体延长半衰期的方法主要有以下几种方式：①通过偶联聚乙二醇（PEG）的方法提高蛋白自身的分子量。②将纳米抗体直接与抗体Fc区相连成融合蛋白。③将纳米抗体与抗HSA的纳米抗体串联；④多个纳米抗体串联形成多价和多特异性纳米抗体。就目前已上市和在研的纳米抗体药物来看，大多是选择将纳米抗体和Fc或者人血清白蛋白HSA融合这种方式来弥补半衰期短的问题，接下来就这两种方式详细介绍原理和效果。

纳米抗体与HSA结合

1. HSA的特点

HSA的X射线晶体结构显示，它是一个心形分子，含有585个氨基酸，它主要由α -螺旋结构构成，缺乏β -折叠，组合成三个同源域DI, DII和DIII，其中每个被分为A和B子域 (DIA, DIB, DIIA, DIIB, DIIIA和DIIIB)，这些域由长而柔性的环连接^[3]。

图3. 白蛋白的三维结构

HSA是人体血浆中含量最丰富、结构最稳定的蛋白质，其浓度约为45 mg/ml (0.6 mM)，循环半衰期长达20天。纳米抗体与HSA结合后（图4），流体力学半径和分子量增加，肾小球过滤减少，体内滞留时间将大大延长；同时借助FcRn介导的再循环作用，半衰期可由数小时延长至3周以上。

图4.白蛋白-纳米抗体非共价结合复合体示意图 

2. 纳米抗体与HSA结合

引入抗HSA的VHH，介导药物与HSA的结合可以有效提高药物的半衰期。目前已经报道了一系列基于抗肿瘤抗原、抗CD16和抗HSA纳米体的双特异性纳米抗体。其中由Ablynx开发的人源化、三价的双特异性纳米抗体Ozoralizumab于2022年9月在日本获批（英文商品名：Nanozora^®），这也是全球首款获批上市的双特异性纳米抗体。Ozoralizumab含有3个纳米抗体结构域，其中2个靶向TNF-α，1个与HSA结合延长药物半衰期，单次给药后平均半衰期t1/2为18.2天。

图5.Ozoralizumab结构示意图

另外，君实生物自Anwita Biosciences引进的JS014是一款创新纳米抗体，其活性成分为重组白介素21-抗人血清白蛋白（HSA）纳米抗体融合蛋白， JS014 高亲和力特异性地结合人 IL-21R 并激活淋巴细胞，通过融合抗 HSA 的单域抗体使 IL-21 的半衰期得到显著延长。目前JS014正在开展晚期恶性肿瘤的临床试验。

纳米抗体偶联抗体Fc片段

1. 抗体Fc片段的结构和功能

抗体Fc片段是抗体的恒定区，在这个恒定区域内氨基酸的序列在不同的抗体中呈现相同的状态，抗体的不同类型，由抗体FC片段的特异性结构来进一步决定。纳米抗体除了半衰期短，由于缺乏单克隆抗体的Fc片段，不具备Fc介导的效应功能，如抗体依赖的细胞介导的细胞毒（ADCC）效应和血清稳定性。自然杀伤细胞（NK）是介导ADCC作用的主要免疫细胞，其细胞表面的Fc受体FcγRIIIa（CD16a）在识别和结合Fc中起关键作用。

2. 纳米抗体偶联Fc片段的研究

纳米抗体可以很容易偶联Fc片段重组人源化重链抗体形式，以实现包括Fc介导的效应因子功能，并增加血液滞留时间，但也将不可避免地降低其扩散优势。选择Fc融合片段，更倾向于选择IgG1 Fc，这和IgG1与Fc受体蛋白的亲和力结合特性有关。

2.1 康宁杰瑞KN035

应用Fc融合技术最成功的纳米抗体药物当属康宁杰瑞的恩维达^®（KN035）。这是康宁杰瑞自主研发的PD-L1单域抗体Fc融合蛋白，也是全球第一个获批上市的皮下注射PD-(L)1抗体，适用于不可切除或转移性微卫星高度不稳定（MSI-H）或错配修复基因缺陷型（dMMR）的成人晚期实体瘤患者的治疗^[9]。KN035的PD-L1结合分子中包含免疫球蛋白Fc区可以使所述结合分子形成二聚体，同时延长所述分子的体内半衰期，约为200小时。

图7. KN035的晶体结构

2.2 复宏汉霖HLX53

2022年12月9日，复宏汉霖宣自主开发的创新型抗TIGIT的Fc融合蛋白（由纳米抗体和野生型 IgG1的Fc端组成）在晚期/转移性实体瘤及淋巴瘤患者中开展的I期临床试验（NCT05394168）完成首例受试者给药。临床前研究结果表明，HLX53具有优异的肿瘤抑制效果且安全性良好^[11]。目前，全球范围内尚无同类抗TIGIT的Fc融合蛋白药物获批上市。

图8. HLX53的抗体结构和作用机制

纳米抗体 PEG化

1. 什么是PEG？

聚乙二醇（PEG）是一种以-CH2-CH2-O-为重复单元的水溶性的聚醚，其结构图如图9所示，在常温下，根据分子量的不同，PEG会从黏流的液体到版结晶的固体。PEG具有很低的免疫原性/抗原性和毒性。PEG化修饰（PEGylation）是将PEG共价结合在药物上，以改善药物的药代动力学、药效学和免疫学特性，从而增强其治疗效果的一种药物技术。PEG化修饰会改变药物的物理化学性质，包括构象、静电结合、疏水性等。这些物理和化学变化增加了药物的体内保留时间，提高血浆半衰期，延长吸收时间，还能影响药物与细胞受体的结合亲和力，改善肿瘤靶向性。药物经PEG修饰后可减少给药次数、提高疗效、改善耐受性、降低严重程度和不良事件发生率。同时PEG还可以增加蛋白质的溶解度和稳定性，有利于药物的生产和储存。因此PEG常被用作药物传递和药物修饰技术，可以直接与药物偶联，或附着在药物表面一起封装于纳米材料里。

图9. 代表性的PEG结构

2. 纳米抗体PEG化研究

ATN-192 是Ablyx 在Ozoralizumab 基础上开发的一种第二代TNFα 纳米抗体，即PEG修饰的长效版本，目前已经完成临床一期。 

其他提高纳米抗体半衰期的策略

1. 多价纳米抗体

科望生物第二款抗体药OX40抗体ES102的临床试验申请获得NMPA受理。ES102是继信达生物IBI101、丽珠单抗、恒瑞医药SHR-1806之后第4款申报临床的OX40抗体。ES102是一种六价纳米抗体的Fc融合蛋白（图10）。其独特设计使得ES102即便在没有外源性交联的情况下也能强效激活OX40通路。据悉，与传统的二价或四价OX40抗体相比较，ES102具有很强的免疫激活能力，并且已经在临床前显示出显著的单药及联合免疫检查点抑制剂PD-1/PD-L1抗肿瘤药效，同时在临床前安全性评价中也展现了良好的安全性特征。目前， ES102正在开展其在临床I期试验。

图 10. ES102的抗体结构

2. 纳米抗体偶联铁蛋白“Fenobody”

将纳米抗体展示在铁蛋白表面，利用铁蛋白亚基的自组装特性而形成的一种笼状蛋白壳。铁蛋白是一种由24个亚基自组装形成的外径为12纳米、内径为8纳米的笼状蛋白。在该工作中，研究人员利用基因工程手段将纳米抗体连接到铁蛋白亚基的C端。结果表明，自组装的铁蛋白亚基成功将纳米抗体以24聚化的形式展示在一个铁蛋白壳表面。

研究人员通过电镜观察Fenobody，发现纳米抗体以4个一簇、一共6簇的形式展示在铁蛋白表面，而且成簇的纳米抗体在空间结构上能够很灵活地暴露抗原结合位点。展示纳米抗体后的Fenobody尺寸增大为21 nm，与抗H5N1纳米抗体相比，Fenobody对H5N1抗原的表面亲和力提高了360倍。他们还在小鼠实验中发现，对比纳米抗体，Fenobody的体内循环半衰期延长了10倍以上。同时，Fenobody在大肠杆菌表达系统中可溶性高效表达，并且具有极好的热稳定性，Tm值达到80摄氏度以上^[12]。

图11. Fenobody的结构和体内半衰期

小结  

纳米抗体因分子量小，半衰期非常短，限制了其临床应用。目前，已经有很多方法可以有效改造以延长半衰期， 其中包括Fc融合、PEG化、白蛋白融合及多价纳米抗体融合等方法，部分方法已经取得临床获批或在临床试验阶段。相信未来还会有更多科学有效的方法出现，也希望能有更多的纳米抗体药物推向临床并且上市，推动人类健康事业的发展。

参考资料：

[1].Yu Z, Lennon V A. Mechanism of Intravenous Immune Globulin Therapy in Antibody-Mediated Autoimmune Diseases[J]. The New England Journal of Medicine, 1999, 340(3): 227-228.

[2] Divsalar, A. et al. Characterization and side effect analysis of a newly designed nanoemulsion

targeting human serum albumin for drug delivery. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2012. 98: p. 80-84.

[3] Lamichhane S, Lee S. Albumin nanoscience: homing nanotechnology enabling targeted drug delivery and therapy. Arch Pharm Res. 2020;43(1):118-133. doi:10.1007/s12272-020-01204-7

[4] Heukers, R., et al., Targeting hepatocyte growth factor receptor (Met) positive tumor cells using  internalizing nanobody-decorated albumin nanoparticles. Biomaterials, 2014. 35(1): p. 601-610.

[5] Altintas, I., R.J. Kok, and R.M. Schiffelers, Targeting epidermal growth factor receptor in tumors: from conventional monoclonal antibodies via heavy chain-only antibodies to nanobodies. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2012. 45(4): p. 399-407.

[6] Roovers, R.C., et al., A biparatopic anti-EGFR nanobody efficiently inhibits solid tumour growth. International journal of cancer, 2011. 129(8): p. 2013-2024.

[7] Hoefman, S., et al., Pre-clinical intravenous serum pharmacokinetics of albumin binding and non half-life extended Nanobodies®. Antibodies, 2015. 4(3): p. 141-156.

[8] Elsadek, B. and F. Kratz, Impact of albumin on drug delivery—new applications on the horizon. Journal of controlled release, 2012. 157(1): p. 4-28.

[9] Fei Zhang., et al., Structural basis of a novel PD-L1 nanobody for immunecheckpoint blockade ,Cell Discovery 3(2017)

[10] 针对程序性死亡配体（PD-L1）的单域抗体及其衍生蛋白，专利CN201510465481.8

[11] Botong Hua, Ming Yang, Jie Xue, Chen Dong, Yi-Ting Mao, Ou Li, Eric Cheung, Hassan Issafras, Wenfeng Xu, Weidong Jiang; Abstract 2451: A novel single domain antibody targeting TIGIT for cancer use in combination therapies. Cancer Res 1 July 2021; 81 (13_Supplement): 2451.

[12] Kelong Fan., et al., Fenobody: A Ferritin-Displayed nanobody with High Apparent Affinity and Half-Life Extension. Anal. Chem., 2018, 90, 5671, DOI: 10.1021/acs.analchem.7b05217

了解更多纳米抗体相关内容，可关注微信公众号，获取最新资讯~