Home > BLOGS > 纳米抗体研发技术

基于质谱技术的纳米抗体开发

Time:2023-05-10 author:本站 read:

2014年洛克菲勒大学大学Fridy等人开发并优化了一种名为Nano MiSeq/MS的新技术,该技术将二代测序(NGS)与质谱相结合,以快速生成大量具有高亲和力和特异性的纳米抗体。


image.png

Fig.Overview of nanobodies produced by high-throughput sequencing and mass spectrometric identification.



该方法基本流程是分离免疫美洲驼的骨髓淋巴细胞,扩增VHH片段,并高通量DNA测序,获得VHH蛋白质数据库,并结合质谱(MS)鉴定源自同一动物血清的VHH片段。基于质谱的数据在VHH蛋白数据库中进行匹配,从而获得VHH序列信息。


在这种方法中,Fridy依据protein A和protein G对HCAb与传统抗体(IgG1)亲和力的不同,在美洲驼免疫后将含VHH的HCAb在血清中进行连续分级(Hamers-Casterman等,1993)。然后将HCAb在抗原偶联的树脂上进行亲和纯化,为了获得高亲和力VHH片段,严格控制洗涤条件,并在树脂上用木瓜蛋白酶消化,以裂解掉恒定区,洗涤后回收VHH片段。将回收后的高亲和力VHH片段采用胰蛋白酶消化和凝胶纯化,并通过LTQ-Velos-Orbitrap质谱分析。为创建抗原特异性的VHH序列蛋白数据库,从免疫后的美洲驼分离淋巴细胞,并提取RNA与合成cDNA。采用巢式PCR特异性扩增编码VHH区的序列,以进行高通量测序。 他们同时开发了Llama Magic web server,利用计算机辅助快速搜索并匹配VHH序列。以GFP与mcherry为抗原进行验证,针对GFP 共获得25条VHH序列,mcherry 获得5条VHH序列,经过SPR验证,抗体亲和力都在几十nM~pM之间。利用同样的方法,Shi Yi教授团队2,3发表了多篇文章,证明了此方法高效与高通量。利用这项技术,作者确定了数千种高亲和力anti-HSA NBs(NbHSA)。在这项研究中,作者制作并系统地描述了一系列用于药物输送的结构多样和亚纳米亲和性NBHSA。通过定量蛋白质组学开发了一种多重药代动力学分析方法,并测定了几十种被挑选出的NBHSA在Alb-/- FcRn人源化小鼠模型的半衰期。


实验结果表明,在HSA模型中,NBHSA具有不同的药代动力学特征,半衰期从1.6天到7.6天不等。在弱酸性pH下,NbHSA的半衰期与其白蛋白结合亲和力呈正相关。为了证明NBHSA的效用,作者通过将几种跨物种的NBHSA与人白细胞介素-2融合,产生了“Duralukin”。Duralukin可以从大肠杆菌细胞中快速产生,具有良好的稳定性和生物活性。利用黑色素瘤小鼠模型,作者证明了Duralukin对癌症治疗的高临床前疗效。


基于质谱的纳米抗体开发,虽然具有非常高的通量,能够通过控制洗脱条件(如高,低pH,盐离子浓度等)获得高亲和力纳米抗体,但这种方法只对简单的大分子比较高效,对于多次跨膜蛋白来说,筛选效率低。其次成本高,需要配备质谱,二代测序仪等昂贵仪器,难度系数大,操作复杂,不仅需要对血清进行纯化,获得特异性多抗外,还需要质谱与NGS分析,工作量巨大。最后获得序列信息后,不能够与表型统一,需要基因大量合成与表达验证,时间周期长,成本高,因此该方法在业界并未大量使用。




参考文献:

1. Fridy, P., Li, Y., Keegan, S. et al. A robust pipeline for rapid production of versatile nanobody repertoires. Nat Methods 11, 1253–1260 (2014). https://doi.org/10.1038/nmeth.3170.

2. Xiang Y, Sang Z, Bitton L, Xu J, Liu Y, Schneidman-Duhovny D, Shi Y. Integrative proteomics identifies thousands of distinct, multi-epitope, and high-affinity nanobodies. Cell Syst. 2021 Mar 17;12(3):220-234.e9. doi:10.1016/j.cels.2021.01.003.

3. Yufei Xiang et al., (2020), Versatile and multivalent nanobodies efficiently neutralize SARS-CoV-2, Science, DOI: 10.1126/science.abe4747.






了解更多纳米抗体相关内容,可关注<阿帕克生物>微信公众号,获取最新资讯~

qrcode_for_gh_8bb67db03ed6_258.jpg

Our customer service representatives are available 24 hours a day, 7 days a week.

联系

电话:400-166-9953

企业邮箱:service@nb-biolab.com

公司地址:成都市温江区青啤大道319号

工作时间:9:00-18:00

Copyright © 2022 四川阿帕克生物科技有限公司 备案号:蜀ICP备2022028448号-2