前言

源自驼科动物重链抗体的VHH谱系基因与人类VH3家族显示出高度序列同源性，但VHH域的抗原结合方式和CDR环结构与常规异源二聚体抗体有很大不同。这些差异包括较长的互补决定区H3（CDR-H3）环，框架2（FWR2）区的替代物，非规范二硫键等。它们被认为是VHH能够在没有配对轻链的情况下依然发挥抗原结合作用的原因所在。

尽管过去的研究已经表明VHH中CDR环的结构特性，有助于理解VHH的CDR环构象和抗原相互作用，但我们对VHH中不同CDR-H3环构象的整体异质性、其功能后果以及CDR-H3异质性的起源的理解仍然有限。本期小编为大家带来关于塑造VHH域中独特CDR-H3构象的解读。

CDR-H3环的构象异质性

由于单体性质以及不同的CDR环构象，VHH域的抗原结合主要由CDR-H3环决定。研究表明，VHH抗体中存在结构上的极化。通过使用传统双链抗体的τ101和ɑ101角度，能够将VHH结构分类为伸展(extended)或弯曲(kinked)CDR-H3的两簇。弯曲CDR-H3构象的VHH占比大，其CDR-H3环更长，与FWR2的相互作用更多，是VHH抗体中典型的CDR-H3构象。而伸展的CDR-H3环长度平均较短，与框架的相互作用较少。

表1. 抗体的基因库来源和框架组成在决定VHH抗体中CDR-H3环的构象和稳定性方面起着至关重要的作用。

图1. 基于CDR-H3环C端构象对VHH抗体的CDR-H3环进行聚类。

a 伸展（顶部，青色）和弯曲（底部，红色）结构的CDR-H3的C端典型构象。黑色粗线突出显示用于CDR-H3环分类的角度α101和τ101。

b 从lama和alpaca中的一组独特VHH结构（n = 385）中α101和τ101角度的分布。

c CDR-H3区域聚类图，伸展（顶部，青色）和弯曲（底部，红色）。

谱系基因如何影响CDR-H3构象

研究发现，VHH抗体的CDR-H3构象与其来源的基因系谱密切相关。IGHV3-3基因衍生的抗体几乎完全采用弯曲CDR-H3构象，而IGHV3S53基因衍生的抗体则大多采用伸展结构的CDR-H3环。弯曲结构的CDR-H3环比伸展结构更长，前者平均长度位为12个氨基酸，后者为9个氨基酸。

图2. 两类CDR-H3构象在其HV谱系基因使用上存在差异。

a 本研究中使用的VHH结构（n = 385）中最常见的7个VH谱系基因的使用情况。

b 来自IGHV3S53谱系基因的独特VHH结构（n = 106）中的α101和τ101角度分布。

c 来自IGHV3-3谱系基因的独特VHH结构（n = 175）中的α101和τ101角度分布。

d 两个llama免疫库VHH结构最常见的7个VH谱系基因的使用情况。

e 基于IGHV3-3（n = 13462，蓝色）或IGHV3S53（n = 18769，橙色）谱系基因衍生的抗体CDR-H3氨基酸长度分布。

f Alphafold预测的来自IGHV3-3谱系基因的23个VHH序列（蓝色）和来自IGHV3S53谱系基因的19个VHH序列（橙色）的α101和τ101角度。

VH基因与CDR-H3聚类之间的相关性与VDJ重组无关

CDR-H3环是由VH、DH和JH片段的组合编码的。llama免疫库测序数据研究显示，尽管来自不同VH基因的抗体具有不同的CDR-H3构象，但其DH和JH基因的使用频率几乎相同，。而CDR-H3长度差异主要源于JH修剪和DH/NP片段长度的差异。因此，VDJ重组中的偏好并不能解释CDR-H3环长度差异，而可能是B细胞发育过程中选择的结果。

图3. 两只Llama 免疫库中IGHV3-3和IGHV3S53衍生的VHH抗体的VDJ连接性质。

a. IGHV3-3和IGHV3S53基因衍生的抗体IGHD片段使用情况。

b. IGHV3-3和IGHV3S53基因衍生的抗体IGHJ片段使用情况。

c. 抗体的Llama IgG2分布。

d. 直方图显示来自IGHV3-3（上方）和IGHV3S53基因（下方）的抗体中VH片段中最3'、端核苷酸位置的分布。

e. 来自IGHV3-3（n = 10304，蓝色）或IGHV3S53（n = 14451，橙色）VH基因的抗体的NP核苷酸和D片段的核苷酸长度分布。

f. 直方图显示了来自IGHV3-3（上方）和IGHV3S53基因（下方）的抗体中IGHJ4片段中最5'端核苷酸位置的分布。

FWR2如何影响CDR-H3构象

FWR2通过影响FWR2与CDR-H3环之间的相互作用来影响CDR-H3构象。源自IGHV3-3基因的VHH结构具有更长且弯曲的CDR-H3构象，它们与疏水性FWR2之间相互作用更多，如pi-堆积相互作用和骨架相互作用，并且具有较长CDR-H3环的VHH不太容易聚集。相反，源自IGHV3S53基因的VHH结构具有较短CDR-H3环和伸展构象，并且与FWR2的相互作用较少，因为它们的亲水性FWR2不易于提供弯曲CDR-H3构象所需的疏水支架。

弯曲和伸展CDR-H3的VHH结构在FWR2序列差异如下：

1.弯曲结构中FWR2的37和47位通常携带Phe，而伸展CDR-H3结构则在这些位置携带Tyr和Leu。

2.FWR2的44位在具有弯曲CDR-H3环的VHH结构中主要是Gln，而在伸展CDR-H3结构中该位置的保守性较低。

有研究表明，将具有弯曲CDR-H3的VHH移植到具有不同FWR2残基的框架上会导致CDR-H3构象的变化和抗体热稳定性的降低，表明了FWR2对CDR-H3构象的直接影响。

图4. 两种结构性CDR-H3聚类的CDR-H3与FWR中序列和结构差异。

a 伸展CDR-H3结构（n = 100）和b 弯曲CDR-H3构象结构（n = 215）中CDR-H3和FWR2之间的接触图。蓝色热力图表示特定残基对在结构中相互作用的比例。使用Chothia编号方案对FWR2和CDR-H3位置进行编号，除了CDR位置95到100x，这些位置从C端对齐以显示CDR-H3 C端的保守相互作用（详见原文）。c 典型的伸展CDR-H3 VHH结构示意图(PDB code 4LDE.A)。d 典型的弯曲CDR-H3 VHH结构（PDB代码3K7U.A）示意图。e 典型的弯曲CDR-H3 VHH结构（PDB代码1U0Q.A）示意图，CDR-H3中含有一个short 3–10 helix。CDR-H3和FWR中的关键残基如棒状表示。

具有伸展或弯曲CDR-H3环的VHH抗体在抗原结合方面的差异

CDR-H3环的构象影响抗原结合。VHH结构主要利用凸起结合模式，可能是为了弥补缺少轻链的情况。为了维持凸起的结合方式，具有伸展CDR-H3构象的VHH/抗原结构利用了暴露在溶剂中的FWR2进行抗原结合，而具有弯曲CDR-H3环的VHH结构则不太可能这样做。结果是具有伸展CDR-H3环的抗体利用了更大的抗原结合区域。这种VHH的弯曲和伸展CDR-H3环之间的抗原结合差异已被先前指出，并用于设计核糖体展示文库以使抗体结合模式多样化。

图5. 具有伸展CDR-H3环的VHH抗体的FWR2经常参与抗原结合。

a 伸展（青色，n = 100）或弯曲（红色，n = 215）CDR-H3的VHH结构中FWR2位置37、45和47的相对溶剂可接触面积的箱线图。b 不同VHH抗体结构中不同区域（FWR1-4、CDR-H1-3）与各自抗原发视相互作用的百分比，伸展CDR-H3构象的VHH（青色，n = 86）和弯曲CDR-H3构象的VHH（红色，n = 162）。

图6. 弯曲或伸展的CDR-H3构象的VHH抗体中不同区域的平均抗原表位贡献。

小结

驼科动物中域抗体的起源尚不清楚，但VHH抗体可能与动物体内常规VH/VL抗体共享其发展过程。驼科动物的VHH抗体表现出VH和JH片段的显著偏向，但除了偏向基因使用外，研究发现CDR-H3环存在结构上的极化，具有截然不同CDR-H3构象簇。这两种构象分别与VH基因的使用方式相关联。在B细胞发育过程中的选择压力与FWR2的生物物理性质共同塑造了VHH独特的CDR-H3环的构象。这些研究工作不仅揭示了VHH抗体的结构多样性，并且也为更好地理解谱系基因如何影响抗原相互作用、免疫库的形成和工程设计提供了重要线索。

参考文献：

Bahrami Dizicheh, Z., Chen, IL. & Koenig, P. VHH CDR-H3 conformation is determined by VH germline usage. Commun Biol 6, 864 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05241-y

了解更多纳米抗体相关内容，可关注<阿帕克生物>微信公众号，获取最新资讯~