自主超突变酵母表面展示（autonomous hypermutation yeast surface display，简称AHEAD^[1]）是一种利用酵母进行抗体生产的方法，它模仿动物体细胞超突变过程。通过在一种易错的正交DNA复制系统上编码抗体片段或突变蛋白片段，表面展示的抗体库通过酵母培养和富集的简单周期持续突变，以进行抗原结合。这样，在短短两周内就可以产生高亲和力克隆。这种方法为抗体发现或突变蛋白筛选提供了非凡的速度、简单性和有效性。

AHEAD的本质是利用了一套正交DNA复制系统，这是一种可以在不干扰宿主复制机制的情况下复制目的DNA的系统（图一）。在该系统中存在两种细胞质质粒：P1和P2，它们分别独立编码质粒自我复制的DNA聚合酶TP-DNAP1和TP-DNAP2。对P1编码的TP-DNAP1进行改造后得到易出错的突变体TP-DNAP1^Y427A，将该突变体反式构建于一个稳定遗传的细胞核质粒中（图二），该细胞核质粒表达出的DNA聚合酶TP-DNAP1^Y427A可以高突变的复制P1质粒，但不提高宿主基因组的突变率^[2]。这会导致p1编码的基因以每碱基10^-5次替换的突变率持续发生超突变，比酵母基因组每碱基10^-10次替换的基因组突变率高100,000倍。如果将抗体或突变蛋白的DNA片段构建在p1上，酵母细胞会自我多样化展示抗体蛋白，并自主探索序列空间。该系统的突变率可以通过对DNA聚合酶TP-DNAP1的改造而显著增加，但不影响基因组复制，从而支持体内连续进化。该过程允许通过连续几轮抗原结合分选来快速改进抗体克隆(图三)，从而在短时间内产生高亲和力、高质量的抗体克隆。

图一 正交复制系统模式图

图一 正交复制系统模式图（正交系统的DNA聚合酶不会对宿主基因组的复制产生影响，正交系统的DNA合成和宿主基因组合成相互独立）

图二 正交复制系统质粒p1/p2

图二 正交复制系统质粒p1/p2（将易突变的TP-DNAP1反式构建于核粒中，表达的TP-DNAP1^Y427A可以复制p1质粒，其中宿主基因组和核粒由宿主核酸聚合酶系统复制，不发生高突变，而p1质粒由TP-DNAP1^Y427A复制，复制过程中发生高突变）

AHEAD系统的搭建和操作流程（图三）

1. AHEAD系统的设计和构建：首先搭建易出错的正交DNA复制系统，通过向酵母细胞中引入编码易出错的DNA聚合酶的质粒来实现，再将需要突变的目的片段插入高突变p1质粒的特定位置。

2. 复制和突变：培养构建的酵母细胞，易出错的DNA聚合酶在复制过程中会向目的DNA引入随机突变，从而导致突变的DNA序列种群多样化。

3. 选择和富集：培养和富集酵母细胞以获得所需的表型，例如抗原结合。使用荧光激活细胞分选(FACS)对酵母细胞进行分类，分离出对抗原具有最高亲和力的细胞。该过程允许选择在DNA中具有突变的酵母细胞，从而改善抗原结合。

4. 质粒提取和测序：从酵母细胞中提取含有抗体片段的质粒，然后进行下一代测序(NGS)，以鉴定抗体库中发生的突变。

5. 迭代周期：该过程重复了几个周期，每个周期都会在抗体库中产生一组新的突变，这样可以持续改进抗体克隆。

6. 抗体生产：生产和纯化高亲和力抗体克隆，用于各种应用。

总而言之，AHEAD过程涉及通过简单的酵母培养和富集抗原结合周期，持续突变展示在酵母细胞表面的抗体库。该过程允许在短短两周内快速生成高亲和力抗体克隆。

图三 自主超突变酵母表面展示（AHEAD）（p1质粒中Ab表示抗体片段；DNAP表示DNA聚合酶；HA表示血凝素标签；Aga2为酵母锚定蛋白亚基；Trp1为色氨酸合成基因，实现p1质粒的稳定传代）

AHEAD系统应用于抗体亲和力提升的案例

该系统被用来生成针对SARS-CoV-2 S糖蛋白和G蛋白偶联受体的强效纳米抗体（图四）。实验方法包括在p1上编码抗体片段，并对其进行连续的分选以进行抗原结合。实验结果表明，持续多样化的抗体迅速得到改善，可以在短时间内产生高亲和力、高质量的抗体克隆。就SARS-CoV-2 S糖蛋白而言，AHEAD生成的纳米抗体对病毒表现出强大的中和活性。与人免疫球蛋白G1（IgG1）抗体同型融合的抗RbD纳米抗体对SARS-CoV-2伪型病毒显示出卓越的中和效力，比其亲本序列改善了约925倍。同时，AHEAD实验的并行性凸显了保持每个亲本克隆谱系分离的价值，因为早期优秀的家系可能无法超过最初表现不佳的谱系，而最初表现不佳的谱系却可能最终产生最强大的中和抗体，比如在所有进化的变异中，纳米抗体RBD1i13和RBD11i12具有最强的病毒中和能力，但它们却来自于中和能力相对较差的亲本。

图四 抗SARS-CoV-2纳米抗体的进化和活性（a、展示了一个抗SARS-CoV-2纳米抗体（母本=RBD10）的亲和力成熟过程，红色多边形为分选的门。b、展示了从不同母克隆开始进行的八个独立AHEAD实验中固定的纳米抗体突变位置。c、展示了使用AHEAD进化的选择性抗SARS-CoV-2纳米抗体的SPR曲线和相关单价亲和力。每个纳米抗体都被测试为固定的Fc融合物，流过其中列出的RBD浓度，RU表示响应单位。d、展示了假SARS-CoV-2病毒上选择性抗SARS-CoV-2纳米抗体的中和活性，每个纳米抗体浓度（x轴）都进行了复测。n=6，误差条代表±s.d.。e、展示了在存在使用AHEAD进化的选择性抗SARS-CoV-2纳米抗体时，测量ACE2竞争RBD结合的生物层干涉仪跟踪。f、在每个母体纳米体的亲和力成熟过程中，从AHEAD的不同循环中分离出的纳米体的亲和力和中和效能的提高。每个填充圆圈代表一个纳米抗体的亲和力，相同颜色的空心圆圈代表纳米抗体的中和效能。每个圆圈内部的数字指定了从中分离出该纳米抗体的AHEAD周期）

AHEAD系统应用于天然文库筛选的案例

AHEAD系统可以编码各种天然抗体库，充当针对任意靶点生成抗体的现成库，成功地从编码在AHEAD上的天然纳米抗体库中筛选到了针对GFP的高亲和力纳米抗体。

总结

1. AHEAD的系统用于快速抗体进化，该系统通过酵母生长和基于FACS的选择使YSD纳米抗体多样化。2. 与自然的体细胞超突变不同，AHEAD缺乏突变热点，但未来的版本可能会模仿突变热点，并包括新的抗体支架和选择方法。3. AHEAD被用来快速进化出针对SARS-CoV-2的强效纳米抗体，从从天然库中分离出来的弱亲和性纳米抗体克隆，在短短1.5-3周的时间内不间断地进化。4. AHEAD的抗体快速进化核心功能应该能够实现更广泛的抗体开发工作。总体而言，AHEAD系统为简化整个抗体生成提供了一个参考模板。

参考文献：

[1] Wellner, A., McMahon, C., Gilman, M.S.A. et al. Rapid generation of potent antibodies by autonomous hypermutation in yeast. Nat Chem Biol 17, 1057–1064 (2021).

[2] Ravikumar, A., Arrieta, A. & Liu, C. An orthogonal DNA replication system in yeast. Nat Chem Biol 10, 175–177 (2014).

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