前言  
目前国内外有多家企业采用酵母表面展示技术用于抗体药物发现，其中将该技术应用最为深入广泛的是Adimab公司。Adimab的核心技术是利用酵母平台进行抗体发现和抗体成熟工程。Adimab是全球唯一拥有商业化人源全长抗体库酵母展示技术平台的公司，独特的酵母技术使得Adimab成为了抗体药开发领域的独角兽企业，凭借这一特点，Adimab与各大知名药企达成了合作，已经帮助各大药企完成超过55种临床药物的开发。信达生物包括信迪利单抗在内的多个抗体药产品都是来源于Adimab的酵母展示技术平台。

本文将介绍目前已经上市的应用酵母展示技术开发的抗体药物以及阿帕克生物使用酵母展示技术筛选纳米抗体的经典案例。

图1 Adimab合作企业

应用酵母展示技术开发的上市和临床中的抗体药物

1.信迪利单抗（Sintilimab）

2018年12月24日，信达生物制药开发的创新药物PD-1抑制剂达伯舒®（信迪利单抗注射液），被批准用于治疗经典型霍奇金淋巴瘤。

信迪利单抗是由酵母展示技术平台开发出的PD-1抗体，能特异性结合T细胞表面的PD-1，阻断导致肿瘤免疫耐受的 PD-1/ PD-L1通路，重新激活淋巴细胞的抗肿瘤活性，从而达到治疗肿瘤的目的。

2.托莱西单抗 （Tafolecimab）

PCSK9是由肝脏产生的丝氨酸蛋白酶，与肝细胞表面的LDL受体(LDL-R)结合，使LDL-R降解，血浆LDL-C水平升高。

目前有 9 款国产PCSK9单抗药物在研，由信达生物利用酵母展示库全人源抗体研发平台研发的托莱西单抗是一种IgG2单克隆抗体，能特异性结合血浆中的游离PCSK9分子，通过减少PCSK9介导的低密度脂蛋白受体（LDLR）内吞来增加LDLR水平，继而增加LDL-C清除，降低LDL-C水平。

托莱西单抗注射液获得了“重大新药创制”国家科技重大专项支持，是国内首个PCSK9递交新药上市申请获受理的，有望成为国内首款获批的自主研发的重组全人源抗PCSK-9单克隆抗体，拟开发用于治疗非家族性高胆固醇血症（non-FH）及杂合子家族性高胆固醇血症（HeFH）等适应症。

3.CD47单抗（Letaplimab)

CD47是一种跨膜蛋白，它通过与巨噬细胞表面的信号调节蛋白(SIRP)相结合，阻止巨噬细胞的吞噬作用。

Letaplimab，也是来源于酵母展示库全人源抗体技术，目前已在临床Ⅱ期阶段。Letaplimab能够阻断CD47与SIRP的结合，进而增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬，并促进了T细胞的交叉激活。

临床前数据显示Letaplimab 作用靶点明确、作用机制清楚、药效显著。连续给药4周，最高无严重毒性反应剂量为100 mg/kg，每周一次，具有较好的安全性。1a期临床数据显示Letaplimab完成了所有预设剂量的爬坡，最高探索剂量为30mg/kg QW，各剂量组均未发生剂量限制性毒性，整体耐受性良好。

阿帕克生物应用酵母展示技术在抗体药物开发中的应用介绍 

1.应用酵母展示技术筛选中和抗体

PD-1是一种免疫检查点抑制剂，主要由细胞表达的PD-L1激活。在癌症中，PD-L1的表达是主要的免疫逃逸机制之一。此类免疫检查点抑制剂的目标是通过阻断负通路来“释放刹车”并增强T细胞活化，增强免疫系统对肿瘤的抵抗。

阿帕克生物使用Human PD-L1蛋白免疫羊驼后，制备纳米抗体酵母表面展示文库。通过磁珠筛选原始文库，富集识别PD-L1的酵母细胞。再利用流式分选技术，分选具有PD1/PD-L1阻断活性的酵母细胞群。再将分选到的克隆进行测序和单克隆流式鉴定，确认所得克隆为满足要求的阳性克隆。PD-1中和抗体筛选策略详细步骤可以参见《应用酵母展示技术筛选阻断活性抗体》一文。

2.识别同源蛋白独特抗原表位的抗体筛选

当靶点的同家族蛋白彼此同源性较高时，采用何种制备技术与筛选方法至关重要。以CD16a(FcγRIII)为例，带您了解阿帕克生物如何应用酵母表面展示技术筛选特异性识别CD16a的纳米抗体。

CD16a(F176)/CD16a(V176)/CD16b同源性高达96%，噬菌体展示技术平台很难筛选到特异识别CD16a，而不识别CD16b的纳米抗体。但是应用酵母表面展示技术，可以在每轮筛选结束后进行FACS鉴定，并且直接分选特定群落的阳性抗体，获得高特异性阳性克隆，以实现特异性识别CD16a抗体的筛选。
阿帕克生物使用CD16a(F176)、CD16a(V176)蛋白混合物免疫羊驼，制备纳米抗体酵母展示文库。对原始文库进行磁珠筛选与流式分选，最终分选出特异性识别CD16a的纳米抗体。项目方案设计和详细筛选策略可以参见《酵母表面展示筛选特定表位纳米抗体》一文。

3.相同表位抗体筛选

阿帕克生物利用酵母展示技术，采用对照抗体竞争筛选的方法，可以实现识别特定表位纳米抗体的筛选。

筛选策略首先采用X抗原进行磁珠富集，将原始免疫文库中识别X抗原的纳米抗体富集出来（图2），通过流式分选仪和对照抗体进行竞争分选（图3），将富集到的克隆进行测序及单克隆流式鉴定，结果显示获得的大部分单克隆能够与对照抗体竞争结合靶抗原(图4)。

图2 磁珠富集产物流式鉴定图谱

左图：未染色的细胞；

中图：单染表达标签HA；

右图：酵母展示抗体抗原X共孵育染色，流式分选得到G门中的细胞。

图3 酵母展示抗体进行抗原表位竞争分选

横轴为表达标签HA的荧光信号，纵轴为结合抗原X的荧光信号。

左一：未染色的细胞；

左二：单染表达标签HA；

左三：酵母展示抗体与抗原X共染色；

左四：酵母展示抗体与对照抗体，抗原X共孵育染色。

图4 单克流式鉴定酵母展示抗体与抗原X结合

横轴为表达标签HA的荧光信号，纵轴为结合抗原X的荧光信号。

酵母展示抗体与抗原X，共孵育染色。

图5 单克隆流式鉴定酵母展示抗体与对照抗体竞争结合

横轴为表达标签HA的荧光信号，纵轴为结合抗原X的荧光信号。

酵母展示抗体与抗原X，对照抗体，共孵育染色。

图4与图5对比可知获得的大部分单克隆能够与对照抗体竞争结合靶抗原。

结语

在酵母表面展示技术平台中，由于可以采用流式分析技术对筛选过程精确控制，更能体现出应用在抗体药物发现过程中的优势。

参考资料：

1. Feldhaus, M., Siegel, R., Opresko, L. et al. Flow-cytometric isolation of human antibodies from a nonimmune Saccharomyces cerevisiae surface display library. Nat Biotechnol 21, 163–170 (2003). https://doi.org/10.1038/nbt785

2. McMahon C, Baier AS, et al. Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies. Nat Struct Mol Biol. 2018 Mar;25(3):289-296. doi: 10.1038/s41594-018-0028-6. Epub 2018 Feb 12. PMID: 29434346; PMCID: PMC5839991.

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