前言

目前存在多种用于从免疫库、合成库或天然库中鉴定抗体候选分子的展示技术，包括噬菌体展示、核糖体展示、mRNA展示、哺乳动物细胞展示和酵母表面展示技术。酵母表面展示技术被广泛应用于大规模抗体库的筛选，并且已产生获批的治疗性抗体。尽管该技术在不断进步，但仍存在一个痛点，即将通过酵母展示发现的Fab片段重新构建为全长IgG抗体的程序十分繁琐（重新构建为IgG是必需的，以发现抗体的全部活性和功能）。

为解决这一难题，研究人员开发了一种新型两步克隆方法，用于将酵母表面展示的抗体库平行转移到哺乳动物双向表达载体中，简化了转录本重构步骤。该研究引入Golden Gate Cloning （GGC） 和双向启动子系统的方法，加快了从YSD Fab文库到IgG生产的转换，从而能够更快地表征针对潜在治疗应用的各种靶标的抗体。通过Golden Gate Cloning，将抗体编码基因和Gal1/10启动子插入到哺乳动物目的质粒中，实现全长ORF的提取，从而在一个反应中转移整个结合分子群。这种方法可避免PCR介导的突变，同时维持重链-轻链的耦合，简化了抗体候选物的批量重构流程，加速发现过程。

图1 从酵母展示载体到工程哺乳动物表达载体的批量重新格式化工作流程概述。

VH，重链可变结构域；VL，轻链可变域；CLκ，轻链κ恒定域；GGC, Golden Gate Cloning；YSD，酵母表面展示；MD, mammalian destination；ORF，开放阅读框；FACS，荧光激活流式分选。

主要研究内容

本研究首先利用治疗性抗PD-L1抗体Durvalumab进行概念验证实验，以建立从酵母表面展示到哺乳动物细胞表达的重构工作流程。

图2 使用Durvalumab验证概念验证研究。

(A) FACS等值线图，显示与不含抗原的阴性对照（灰色）相比，Durvalumab Fab的展示及其结合生物素化PD-L1（蓝色）的能力。x轴检测抗体在酵母表面的展示，y轴检测PD-L1结合。

(B)在Expi293-F细胞中产生的Durvalumab(上样10 μg/ml)与PD-L1的亲和力测定。

随后，研究者从接受TAMR免疫的转基因大鼠样本中构建了Fab抗体文库，并利用这种精简的方法对文库进行了筛选、重构和表达纯化。TAMR受体家族包括Tyro3、Axl和MerTK,属于受体酪氨酸激酶家族，由于与多种疾病有关，十年来一直是研究热点。通过NGS测序分析，获得的抗体变体展现出合适的生物理化学性质，并覆盖了全部的VH多样性。

实验流程

免疫
将编码TAMR靶标的基因免疫接种到OmniRat中，待抗体水平达到足够高时，提取其淋巴结和脾脏。

文库构建
从免疫后的组织中提取总RNA，通过反转录合成cDNA。然后进行两轮嵌套PCR扩增抗体可变区基因，并引入酵母展示载体克隆所需的限制性内切酶位点。采用Golden Gate克隆方法将扩增产物与酵母载体连接，构建Fab酵母展示文库。

文库筛选
利用FACS对酵母细胞进行两轮富集筛选（图3）。第一轮使用TAMR-His6蛋白作为靶标，第二轮使用TAMR-Fc蛋白。每轮结束后对富集池进行质粒提取。

图3 TAMR酵母文库的流式分选。

横轴上描绘了与TAM受体的靶标结合，分别使用针对TAMR-His或TAMR-Fc的抗His-AlexaFlour647缀合抗体或抗人IgG-PE缀合抗体。纵轴上显示了表面展示信号，分别使用山羊F(ab’)2抗人Kappa-AlexaFluor647或-PE缀合物检测。

NGS测序分析
对初始文库和富集后两轮的质粒进行VH/VL区域扩增，并进行NGS测序，分析抗体多样性（图4）。

图4 第二轮筛选产物的NGS测序结果。

(A)第二轮排序后由VH和VL序列分隔的VH和VL序列的树视图。树图是使用Geneious Prime生成的。颜色编码对应于B中所示的10个单克隆中分离的VH/VL序列。

(B)表示在10个分离的克隆中发现的VH和VL。矩形代表VH簇，而椭圆形代表VL序列。

抗体重构
从富集后的酵母质粒池中，利用Golden Gate克隆将Fab片段直接重构插入到哺乳动物双向表达载体中，保留配对信息。

瞬时转染表达
将重构后的质粒瞬时转染至Expi293细胞中，进行抗体表达。6天后收集细胞上清液。

抗体纯化和表征
利用亲和层析对目标抗体进行纯化（图5A），并进行生物理化学表征，包括亲和力（表1）、热稳定性和分子量（图5B）等。

图5 单克隆的表征。

(A)SEC图谱和(B)还原条件下的SDS-PAGE分析，显示各自的重链(HC)和轻链(LC)的预期分子量。(A)中的曲线在x轴和y轴上分别微移1和10个数据单位。颜色编码代表所识别的不同单克隆。

表1 使用His6-TAMR通过BLI测量确定纯化的TAMR抗体的亲和力

小结

该研究开发了一种简单的重构方法，利用Golden Gate克隆技术将从酵母展示系统富集的抗体文库批量克隆到哺乳动物表达载体中，保留了重链-轻链的配对信息，大大减少实验操作时间。虽然单链抗体存在缺陷，但利用Fab展示文库进行筛选更接近最终的抗原结合格式。

未来，该方法可与B细胞克隆技术相结合，保持天然重链-轻链配对。此外，该方法还可与其他展示技术相结合，充分发挥每种展示技术的优势，但不受其缺点的限制，例如，将噬菌体展示文库的更大多样性与酵母表面展示的高亲和力抗体筛选结合起来，可以减少发现流程中的筛选步骤，或者构建不同Fc变体的载体池，为双特异性抗体的发现做准备。

综上所述，该方法实现了从酵母展示到哺乳动物表达载体的高效重构，提供一种更有效和简化的方法，加快了抗体药物的发现过程。

参考文献：

Fiebig D, Bogen JP, Carrara SC, Deweid L, Zielonka S, Grzeschik J, Hock B, Kolmar H. Streamlining the Transition From Yeast Surface Display of Antibody Fragment Immune Libraries to the Production as IgG Format in Mammalian Cells. Front Bioeng Biotechnol. 2022 May 10;10:794389. doi: 10.3389/fbioe.2022.794389. PMID: 35620472; PMCID: PMC9127228.

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