前言

目前单克隆抗体药物主要采用CHO生产，但CHO生产昂贵且耗时，因此开发CHO替代生产系统十分有必要。基于酵母生产的单克隆抗体因快速、低成本和可扩展的发酵过程具有吸引力，但是酵母生产分泌IgG抗体仍然具有挑战性，全长IgG抗体在毕赤酵母中的表达成功的案例仅有少数报道，并且大多数都涉及抗Her2抗体曲妥珠单抗（赫赛汀）。因此，研究者将目光聚焦在更为简单的纳米抗体(VHH)上，采用VHH-Fc这一表达形式验证酵母生产IgG抗体的可行性。

VHH-Fc抗体表达设计

在前期研究中，研究者开发出可以同时中和SARS-CoV-1和SARS-CoV-2的VHH。研究者将VHH与hIgG1 Fc融合在毕赤酵母中进行表达。为了进一步优化在酵母菌中表达，研究者调整了hIgG1序列，包括截断铰链前5个氨基酸(EPKSC)以去除二硫键与常规全长抗体中的轻链结合、保留Fc C末端赖氨酸、进行N297A突变(糖型修饰)等，这种Fc改造产生的结构被称为“（Pichia）FcGen1”（图1A）。先前研究发现，糖链缺失会降低VHH-Fc分子稳定性。通过在VHH-Fc的引入额外二硫键，可恢复或增加热稳定性。因此，研究者在CH2中引入R292C和V302C突变，以引入额外的二硫键，命名为“（Pichia）FcGen2”（图1A）。

图1. 在毕赤酵母中生产的Fc工程化VHH-Fc分子和理化性质

VHH-Fc抗体表达和表征

随后，设计的VHH Fc在毕赤酵母中生产并进行表征。为了扩大筛选的范围，研究者从大量多样的VHH开始，与两种工程化的Fc构建体（命名为“VHH1至6”）并行测试。首先，结果表明，向Fc中添加二硫键对分子的分泌性没有明显影响。可以使用protien A色谱法和排阻色谱法以足够的产率纯化Fc工程化分子。

采用质谱（MS）鉴定了纯化产物的分子组成（图1D）。MS还揭示了O-甘露糖基化，以及N端Gln向Pyro-Glu的转化（后者仅在VHH6中存在）。此外，还表征了分子的热稳定性，疏水性和聚集趋势，因为这些是候选生物制剂开发中的关键属性。正如预期的那样，与FcGen2构建体中存在的具有额外二硫键的分子相比， VHH-FcGen1显示出热稳定性降低（图1C）。在Fc区添加二硫键不会影响疏水性（图1E）。值得注意的是，两种毕赤酵母产生的Fc工程抗体的疏水性均低于CHO细胞生产的XVR011，这可能是因为由于CH2中不存在N-聚糖而形成了更紧凑的构象（图1E）。此外， FcGen2分子在加速实验（40℃下10天）中显示出较低的形成可溶性和/或不溶性聚集体的趋势，与CHO细胞生产的N-糖基化XVR011相比，稳定性相当或者更好（图1F）。在高浓度PEG3350存在下，毕赤酵母产生的VHH Fc也显示出降低的疏水性和聚集趋势（图1G）。总体而言，毕赤酵母产生的稳定的非糖基化VHH-FcGen2显示出理想的物理化学性质。

继续使用抗Covid（VHH1和VHH2）Fc工程化的VHH Fc分子进行体外药效测试。不同毕赤酵母产生的VHH Fc变体与SARS-CoV-2 RBD和spike的结合，或体外中和效力均不受Fc工程改造的影响（图2A-C）。与XVR011相比，毕赤酵母生产的VHH-Fc在ELISA上对SARS-CoV-2 RBD和spike蛋白显示出更高的亲和力，在VSV SARS-CoV-2 spike假病毒中和测定中的效力略高，并且在体外中和SARS-CoV-2病毒并减少斑块形成方面具有类似的效力（图2D）。此外，基于深度突变扫描，毕赤酵母生产的VHH2-FcGen2的识别表位与CHO细胞生产的XVR011的识别表位非常相似（图2E）。

测试了VHH-Fc在仓鼠体内中和SARS-CoV-2效力。在仓鼠感染后24小时腹膜内注射1和4 mg/kg剂量的VHH1-FcGen2，VHH2-FcGen2或XVR011。对照动物注射4 mg/kg靶向呼吸道合胞病毒的帕利珠单抗（Synagis）。除一个异常值外（由错误注射引起），在任何4 mg/kg VHH-Fc处理的仓鼠的肺匀浆中均未检测到感染性病毒，（图2F-G）。令人惊讶的是，VHH-Fc在1 mg/kg的较低剂量下也显着降低感染性病毒的滴度，而XVR011则没有。VHH2-FcGen2的体外效力比VHH1-FcGen2增加了两倍，但并未转化为更高的体内效力。然而，与CHO细胞表达的XVR011相比，两种毕赤酵母表达的VHH-Fc在1 mg/kg时肺部感染病毒水平降低更多。

图2. 在毕赤酵母中生产的Fc工程化VHH-Fc分子的生物学活性检测

总结

本文验证了采用毕赤酵母表达VHH-Fc抗体的可行性，发现表达的VHH-Fc在稳定性，聚集等理化性质和体内体外药效上均有良好的表现。该项研究为后续采用毕赤酵母生产VHH-Fc，或生产IgG抗体提供了参考，有益于降低单克隆抗体药物生产成本，推进单克隆抗体药物的商业利用。

参考文献：

Lonigro, C., et al. (2024). Yeast-based production platform for potent and stable heavy chain-only antibodies. https://doi.org/10.1101/2024.03.04.580093

了解更多纳米抗体相关内容，可关注<阿帕克生物>微信公众号，获取最新资讯~