前言

酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 是生物技术领域中常用的微生物之一，因其在大规模生产、具有真核后翻译修饰能力以及遗传学良好表征等方面的优势，被广泛用作异源蛋白表达的宿主。然而，许多异源蛋白在酵母中表达时面临着进入或有效通过分泌途径的挑战，导致产量低下。同时，在蛋白质工程中，酵母表面展示技术也因实现高水平重组蛋白表达而备受关注。为了解决这些问题，科学家们开发了酵母模块化克隆(MoClo)工具包，该工具包利用IIS型限制性内切酶从标准化部分高效组装表达载体。本文将介绍该工具包的扩展及其在优化酿酒酵母中异源蛋白分泌和表面展示中的应用。

酵母中的蛋白质分泌和表面展示

在酿酒酵母中，蛋白质分泌通常由信号肽(SP)启动。SP通过后翻译或共翻译转运机制(如Sec和SRP依赖途径)将分泌蛋白引导进入内质网 (ER)。信号肽包括带正电荷的N区、疏水性α螺旋H区和含有切割位点的C区，这些区域对于蛋白质的高效分泌至关重要。

除了蛋白质分泌，酵母表面展示技术也在蛋白质工程中有着广泛应用。表面展示技术通过将目标蛋白质锚定在酵母的细胞表面，使其能够与外界环境相互作用。这对于抗体筛选、疫苗开发和酶工程等具有重要意义。然而，实现高效的表面展示也面临诸多挑战。

图1. 构建及组装策略示意图。

(A) 将不同类型的氨基端分泌促进序列与目的蛋白和羧基端3xFLAG-6xHis标签结合,评估其分泌效率,或与HA表位标记的锚定蛋白结合用于表面展示实验。
(B) 使用酵母模块化克隆工具箱中的标准部件,评估一系列分泌促进序列(SP)和转录因子蛋白(TFP)的酵母表达构建体,除了3a'和3b'部件是通过自定义的突出序列(红色文字)连接的。
(C) 类似的表达构建体被用来评估酵母表面展示锚蛋白,它们被组装为标准的4a部件类型,编码有一个柔性连接子(GGGGSGGGGS)、一个HA表位标签和一个TEV蛋白酶切位点,位于锚定蛋白的上游。
POI=目的蛋白

MoClo 工具包的扩展

MoClo 工具包的工作原理是利用 IIS 型限制性内切酶，通过标准化部分高效组装表达载体。为了进一步优化异源蛋白分泌和表面展示，该研究扩展了 MoClo 工具包，增加了16种信号肽 (SPs) 和翻译融合伙伴 (TFPs)，以及5种表面展示锚定蛋白。这些扩展部分经过充分表征，可以更高效地引导异源蛋白通过酵母的分泌途径，并实现高效的表面展示。

研究方法

在实验中，研究人员使用五种不同的目标蛋白，以验证分泌促进信号的有效性。通过比较细胞内和分泌蛋白水平，评估每个信号肽和翻译融合伙伴对蛋白质分泌效率的影响。此外，还研究了信号肽与表面展示锚定蛋白的组合，观察其对表面展示效率的影响。

研究结果

研究结果显示，不同的信号肽和翻译融合伙伴对异源蛋白的分泌效率有显著影响。对于每种目标蛋白，最佳的分泌促进序列各不相同。例如，某些信号肽对某些蛋白质的分泌有显著促进作用，而对其他蛋白质则效果不佳。

图2. 评估一系列分泌促进序列对纳米抗体和mRuby2荧光蛋白表达的影响。

使用所示的分泌信号肽(SP)和转录因子蛋白(TFP)将重组蛋白靶向分泌。通过Western印迹检测细胞培养基和细胞沉淀物中的分泌和胞内蛋白,并检测羧基端6xHis标签。
(A) 利用所有SP和TFP,anti-GFP纳米抗体都能很好地分泌(上图),且可以从表达GFP的HEK293T细胞裂解物中捕获GFP,证实其功能性(下图)。
(B) 只有一半的SP和一个TFP能有效地促进mRuby2荧光蛋白的分泌,这通过Western印迹(上图)和对培养基进行荧光测量(下图)得到验证。
(C) 野生型和工程化的MFα前体-前体信号肽变体在促进mRuby2分泌方面存在显著差异,这通过Western印迹(左图)得到证实。定量了三次独立实验的蛋白水平(中图),并计算了培养基与细胞沉淀物样品中蛋白水平的比值,作为相对分泌效率的指标(右图)。分子量标记的大小以kDa为单位标示。误差线代表标准误差。

图3. 利用SP/TFP系统进行甜味蛋白的重组生产。通过Western印迹评估重组甜味蛋白的表达和分泌情况,如前所示。

(A) 大部分但并非全部的SP和TFP能够促进brazein的适度分泌。
(B) 在促进单链monellin最佳分泌的SP和TFP之间存在显著差异。分子量标记的大小以kDa为单位标示。

此外，研究还发现，信号肽与表面展示锚定蛋白的组合对表面展示效率也有重要影响。一些特定的组合能够显著提高重组蛋白在酵母表面的展示水平。这些发现表明，选择合适的信号肽和锚定蛋白组合，对于实现高效的蛋白质分泌和表面展示至关重要。

图4. 评估五种锚定蛋白用于anti-GFP纳米抗体的表面展示。将anti-GFP纳米抗体与所示锚定蛋白及AGA2前分泌信号肽(A)或MFαpp8前体-前体信号肽(B)一起在酵母细胞中表达。使用Alexa-488荧光素标记的抗HA抗体或GFP蛋白结合的方式,通过流式细胞术评估其表面展示。未转化的BY4741细胞作为阴性对照。图中显示了FL1信号(Alexa-488或GFP荧光;Y轴)与前向散射(FSC;X轴)的关系,以及阳性染色细胞的百分比。

结论

通过扩展酵母模块化克隆 (MoClo) 工具包，研究人员提供了一组经过充分表征的信号肽、翻译融合伙伴及表面展示锚定蛋白。这些工具能够帮助科学家高效筛选和优化酿酒酵母中的异源蛋白分泌和表面展示。该研究突显了使用 MoClo 工具包在蛋白质工程中的优势，通过组合信号肽、翻译融合伙伴和锚定蛋白，显著提高了蛋白质分泌效率和表面展示水平，为基础研究和工业应用提供了新可能性。

未来，随着更多信号肽和锚定蛋白的发现和表征，MoClo 工具包有望进一步扩展和优化，为生物技术领域带来更多突破。这项研究展示了科学家在优化酵母表达系统方面的努力和成果，预示着未来在生物制药、疫苗开发和酶工程等多个领域的发展潜力。

参考文献：

O'Riordan NM, Jurić V, O'Neill SK, Roche AP, Young PW. A Yeast Modular Cloning (MoClo) Toolkit Expansion for Optimization of Heterologous Protein Secretion and Surface Display in Saccharomyces cerevisiae. ACS Synth Biol. 2024 Apr 19;13(4):1246-1258. doi: 10.1021/acssynbio.3c00743. Epub 2024 Mar 14. PMID: 38483353; PMCID: PMC11036508.

了解更多纳米抗体相关内容，可关注<阿帕克生物>微信公众号，获取最新资讯~