背景

CD19作为B细胞表面特异性标志物，是用于治疗B细胞恶性肿瘤，如急性淋巴细胞性白血病（ALL）和淋巴瘤的理想靶点。然而，CD19的细胞外域（ECD）容易聚集和错误折叠，为开发和分析CD19靶向治疗带来了挑战。研究团队通过工程化改造，成功获得稳定的CD19-ECD（SuperFolder）变体，这些变体显示出改善的表达率，并且与野生型蛋白相比，能够有效地以单体形式纯化。

研究方法

研究人员采用了酵母表面展示技术结合定向进化策略，通过随机突变和高通量筛选，从大量候选变体中筛选出稳定性提高的CD19-ECD变体。通过流式细胞术（FACS）和热稳定性测试，对变体的稳定性和表达特性进行了评估。

初步实验设计

设计四种不同的CD19-ECD构建体，包括是否包含信号肽（SP）和外显子5（E5），并通过抗标签抗体（anti-HA和anti-c-myc）及抗CD19抗体（FMC63和HIB19）进行检测。实验结果显示，不包含信号肽和外显子5的构建体表现最佳（图1A）。

文库构建和筛选

利用错配PCR（error-prone PCR）对CD19-wt基因进行随机突变，生成初始文库。随后，通过流式细胞术（FACS）进行多轮筛选。每轮筛选中，细胞首先用抗HA抗体染色以标准化表达水平，然后根据与FMC63或anti-c-myc抗体的结合情况进行选择。在某些轮次中，额外加入48°C的热孵育筛选步骤以增加选择压力，从而筛选出具有更高热稳定性的变体。

活性分析

在多轮筛选后，研究团队对最终筛选出的库进行分析。通过流式细胞术检测表面展示的CD19-ECD与抗体的结合情况，结果显示筛选后的库与初始的CD19-wt相比，表现出显著改进的折叠和稳定性。

图 1. 用于筛选CD19-ECD 稳定变体的实验策略和酵母表面展示实验流程。(A) 酵母展示 CD19-ECD 的示意图，检测的四种不同 CD19-ECD 结构与抗-HA 和抗-c-myc以及特异性针对 CD19-ECD 结构的单克隆抗体（FMC63 和 HIB19）的结合能力。(B) FACS筛选策略示意图。(C) 酵母展示的 CD19-野生型和分选后库比较。

研究结果

通过多轮筛选成功获得了稳定的、天然折叠的CD19-ECD变体。这些变体表现出更好的折叠性能和更高的热稳定性（图2），并在HEK293细胞中显示出更高的可溶性表达量（图4）。

图2 富集的SuperFolder变体表现出更好的结构完整性和热稳定性。

图3 SuperFolder突变在CD19-ECD结构中的位置

图4 可溶性表达SuperFolder变体产生单体蛋白

最佳突变体SF05的优势

1. 热稳定性和表达量：SF05变体在48°C测试中表现出显著的热稳定性，并且在HEK293细胞中的可溶性表达量显著高于野生型CD19。

2. 单体蛋白的纯化：与野生型CD19不同，SF05变体能够以单体形式高效纯化，避免了蛋白质聚集问题。

3. 单价亲和力分析：SF05变体用于分析在原代人T细胞上表达的CD19定向CAR（基于FMC63 scFv）的单价亲和力，结果显示其在检测和表型分析方面具有极高的实用性。

4. CAR-T细胞检测：SF05变体成功用于患者样本中CAR-T细胞的检测和表型分析，能够通过多参数流式细胞术进行CAR-T细胞频率的定量和CAR表达水平的分析。

图 5. FMC63-CARs的单价亲和力分析及患者体内CAR-T细胞的监测。

小结

SuperFolder CD19-ECD变体的开发，为癌症免疫治疗特别是在B细胞恶性肿瘤提供了新的工具。这些变体不仅可用于基础免疫学研究，还有助于CD19靶向疗法的开发和监测。特别是SF05变体，通过其与CD19-CAR的单价亲和力研究，以及在淋巴瘤患者血液中CAR-T细胞的监测和表征，证明了在临床应用中的潜力。

同时，该项研究成功展示了定向进化和酵母表面展示技术的强大功能，不仅解决了CD19-ECD的稳定性和表达问题，还为其他"难以表达"的蛋白质提供了宝贵的经验和启示。

参考文献：

Laurent E, Sieber A, Salzer B, Wachernig A, Seigner J, Lehner M, Geyeregger R, Kratzer B, Jäger U, Kunert R, Pickl WF, Traxlmayr MW. Directed Evolution of Stabilized Monomeric CD19 for Monovalent CAR Interaction Studies and Monitoring of CAR-T Cell Patients. ACS Synth Biol. 2021 May 21;10(5):1184-1198. doi: 10.1021/acssynbio.1c00010. Epub 2021 Apr 12. PMID: 33843201; PMCID: PMC8155657.

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